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Henrique, Domingos
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Células Estaminais & Neurogénese

Durante o desenvolvimento embrionário, vários processos de regulação genética controlam o potencial de diferenciação celular, de modo a que os vários tecidos e órgãos sejam corretamente formados. Embora todas as células possuam idêntica informação genética, esta é explorada de forma diferente por cada célula, de acordo com o seu historial e com a sua posição no embrião.No nosso laboratório, pretendemos elucidar: i) quais as regras que delimitam o "espaço genético" disponível para cada célula indiferenciada no embrião; e ii) como é que estas células exploram esse espaço durante os processos de decisão celular.

Para responder a estas questões utilizamos dois modelos: no primeiro modelo, analisamos células estaminais embrionárias de murganho de modo a estudar os mecanismos que regulam a sua pluripotência e as escolhas que efectuam durante a diferenciação; no segundo modelo, estudamos a retina neural embrionária, com o objectivo de investigar como é que as células progenitoras adquirem competência para produzir todos os tipos neuronais que compõem a retina adulta.

Em ambos os modelos, o objectivo principal consiste em compreender as redes de regulação que controlam o potencial celular de células progenitoras estaminais e, simultaneamente, governam os processos de decisão que as células adoptam para formar correctamente os vários tecidos e orgãos.

  • Áreas de Investigação

    • Neurogénese e Sinalização Notch
    • Pluripotência e Nanog
  • Equipa de Investigação

    • Projectos de Investigação em Curso

      • 2010/2013 "The dialetics of "Stemness": from biology to mathematics", Coordinator: Domingos Henrique. PTDC/SAUOBD/100664/2008
      • As células estaminais são caracterizadas pela sua capacidade de auto-renovação e pela sua competência para diferenciação em várias linhagens (pluripotencialidade). A relevância deste tipo celular advém do seu contributo fundamental quer para o desenvolvimento de um organismo, quer para o seu crescimento e manutenção. Um tipo particular de células estaminas são as células estaminais embrionárias (CEE), as quais podem ser derivadas da massa celular interna do blastócisto e podem ser mantidas "in vitro" em condições de cultura bastante específicas. Estas células possuem a capacidade de gerar células de todos os tecidos embrionários e, consequentemente, constituem uma fonte celular de elevado potencial na área emergente da medicina regenerativa. Em 2006, foi descrita uma descoberta efectuada por Takahashi e Yamanaka de que a expressão ectópica de apenas 4 genes (Oct4,Sox2,Klf4 e c-Myc) é capaz de reprogramar fibroblastos embrionários de murganho em células pluripotentes idênticas a CEEs, designadas por células estaminais pluripotentes induzidas–células iPS. Desde então, diferentes estudos têm reportado a reprogramação de vários tipos de células somáticas, incluindo células somáticas adultas.
      • Estes avanços científicos possuem multiplas implicações terapêuticas, nomeadamente no que diz respeito ao uso de células iPS para modelação de várias doenças "in vitro", através da criação de células iPS paciente-específicas. No entanto, o fenómeno de reprogramação geneticamente induzida é ainda bastante ineficiente, podendo ser considerado como uma "caixa negra" no que diz respeito à natureza e sequência de eventos que ocorrem ao longo do caminho para recriar o estado "estaminal". Esta falta de conhecimento constitui um obstáculo ao uso generalizado de células iPS em medicina regenerativa e salienta a necessidade de um conhecimento mais extenso acerca dos mecanismos genéticos e bioquímicos que estão na base do processo de reprogramação.
      • Recentemente, uma nova definição para o estado "estaminal", em termos de estado basal não instruido que se mantém na ausência de factores indutivos de diferenciação, conduziu a avanços importantes nesta área. A aplicação deste novo conceito à geração de células iPS poderá conduzir a estratégias mais racionais que induzam o estado "estaminal" em células somáticas de uma forma mais eficiente, tal como já reportado para a eficiente conversão de células estaminais neurais em células iPS. O mecanismo regulatório que está na base do estado "estaminal" tem sido extensivamente dissecado e a visão actual indica que a rede de factores de transcrição Nanog, Oct4 e Sox2 (NOS) funciona em conjunto no topo deste circuito. No entanto, como é que o estado "estaminal" emerge da interacção desta rede de factores é ainda desconhecido, apesar da caracterização dos vários factores intervenientes e mecanismos de auto/"cross"-regulação. Sendo assim, neste momento, o desafio reside na compreensão do comportamento dinâmico da rede NOS, bem como nas propriedades emergentes que estão na base do estabelecimento do estado "estaminal".
      • Este projecto, tem como ponto de partida a heterogeneidade descrita para a expressão de Nanog quer em CEEs quer na massa celular interna de blastócistos. Estas observações, em conjunto com evidências de que os níveis de expressão de Nanog são flutuantes, sugere um possível mecanismo oscilatório da actividade do gene Nanog. O nosso laboratório, no IMM, tem vindo a desenvolver trabalho noutro mecanismo regulatório que também possui caracter oscilatório (a via Notch). Sendo assim, rapidamente reparámos nas implicações funcionais das oscilações de Nanog, no que diz respeito à natureza do estado "estaminal". Estávamos também despertos para a necessidade de usar métodos quantitativos e dinâmicos para monitorizar estas oscilações, de modo a que a aplicação de modelos matemáticos possa ser usada para extrair novos dados sobre a arquitectura funcional do circuito genético NOS.
      • O nosso objectivo consiste, portanto, em utilizar uma abordagem sistemática de modo a perceber esta arquitectura, como é que ela se traduz nas oscilações observadas nos níveis de expressão de Nanog, e como é que estas fluctuações podem estar na base do aparecimento da natureza dialéctica do estado "estaminal": um estado no qual células individuais são capazes de simultaneamente manisfertar as suas propriedades de auto-renovação e pluripotência, enquanto se mantêm "abertas a propostas", i.e. prontas a responder a estimulos de diferenciação.
      • O laboratório no IMM tem acumulado ao longo do tempo conhecimentos na área das células estaminais embrionárias, pelo que consideramos que, como equipa, estamos numa posição excelente para endereçar a questão: "como é que o circuito NOS funciona para gerar o estado "estaminal".
      • 2012/2014 "The V2 domain of the spinal cord as a model to study neuronal fate decisions", Coordinator: Domingos Henrique. PTDC/SAU-BID/121846/2010
      • O trabalho pioneiro de Ramon y Cajal providenciou a primeira descrição compreensiva da complexidade celular do sistema nervoso dos vertebrados, tendo fornecido o enquadramento fundamental para a questão de como a identidade neuronal é gerada durante o desenvolvimento. Após um século, está bem estabelecido que a organização anatómica complexa do sistema nervoso é precedida de uma cascata de eventos moleculares regionalizantes no neuroepitélio, que se inicia nos estadios iniciais do desenvolvimento embrionário e resulta na delimitação de domínios de progenitores específicos, cada um expressando combinações únicas de factores de transcrição (TFs). A compreensão de como são gerados tipos neuronais distintos pode, assim, ser reduzida à questão de como são estabelecidos os mecanismos de expressão génica combinatorial durante o desenvolvimento. Duas estratégias principais parecem ser usadas, a primeira envolvendo programas intrínsecos aos progenitores, os quais regulam de uma maneira celular autónoma a sequência dos tipos neuronais produzidos, e a segunda baseada na comunicação entre células de progenitores, como determinante principal dos tipos neuronais gerados.
      • O desafio consiste, assim, em elucidar como a interacção entre factores intrínsecos e extrínsecos determina a aquisição de programas específicos de diferenciação neuronal. Estes resultados serão cruciais para compreender como os circuitos neuronais são montados no cérebro e como é que eles controlam comportamentos específicos no adulto, um dos maiores desafios da neurociência "moderna". Adicionalmente, este conhecimento será critico no design mais racional de estratégias para produzir tipos neuronais específicos a partir de células estaminais embrionárias e células estaminais pluripotentes induzidas, um passo fulcral para o desenvolvimento de terapias regenerativas.
      • A espinal medula constitui um modelo excelente para estudar os mecanismos subjacentes à especificação das identidades neuronais no sistema nervoso central em desenvolvimento e, neste projecto, propomos investigar as estratégias moleculares subjacentes à produção de tipos funcionais distintos de interneurónios numa região particular da espinal medula, o domínio V2. O nosso trabalho anterior tem contribuído para elucidar algumas das características da neurogénese do domínio V2, nomeadamente no que diz respeito à sua coordenação pela acção de factores extrínsecos, com a sinalização Notch sendo mediada por dois ligandos Dll diferentes, e de factores intrínsecos, como os genes proneurais bHLH Ascl1 e Ngn1/2. Neste projecto, propomos caracterizar os componentes principais da rede regulatória do domínio V2 e investigar como é que estes componentes interagem funcionalmente de
        modo a especificar o número e tipo de interneurónios deste domínio.
      • Na primeira parte do projecto, estudaremos a função dos genes bHLH proneurais Ascl1 e Ngn1/2, durante as etapas iniciais do desenvolvimento da linhagem V2, nomeadamente como é que estes genes controlam a competência dos progenitores V2. De seguida, estudaremos qual o papel dos dois ligandos Notch, Dll1 e Dll4, neste processo, de modo a elucidar como é que eles se integram na rede regulatória V2 e quais as decisões de destino celular é que eles controlam. Por fim, propomos efectuar uma série de experiências de fate-mapping, de modo a revelar qual a ordem de expressão dos vários TFs, ao longo dos vários passos de desenvolvimento neuronal do domínio V2, e a identificar quais os factores candidatos a estarem upstream dos dois genes Dll. Esta informação será utilizada como ponto de partida para dissecar os passos regulatórios da rede V2 na qual o Dll4 participa, através da definição das regiões de promotores responsáveis pela sua expressão nas células V2 e através da identificação de quais os TFs (bHLH e outros) que se ligam directamente nestas regiões e contribuem para a expressão do Dll4.
      • No seu conjunto, este projecto contribuirá para um melhor conhecimento da rede regulatória do domínio V2 bem como para elucidar como a coordenação de factores intrínsecos e extrínsecos regulam decisões de destino neuronal. A longo prazo, prevemos que este projecto contribua para atingir uma visão mais compreensiva da lógica molecular utilizada na especificação neuronal durante o desenvolvimento do sistema nervoso.
    • Prémios

      • BioMedCentral Neuroscience, Neurology and Psychiatry Award 2012 pelo artigo publicado em BMC Biology: "A novel reporter of notch signalling indicates regulated and random notch activation during vertebrate neurogenesis"
      • Melhor Poster a Catarina Ramos em Sinal 2012 - 6th National Meeting on Cell Signalling. 2012, Braga, Portugal: "The role of different Notch ligands in the control of spinal cord neurogenesis"
      • 1º prémio no concurso 'The Physics of Life', EMBO BMD2011 Workshop. 2011, Oeiras, Portugal: 'The Heart of a Brain'
      • Melhor Poster ESTOOLS a Elsa Abranches no ESTOOLS scientific symposium - Stem Cells in Biology and Disease. 2010, Lisboa, Portugal: "From ES cells to Neurons Dissecting Notch function during Neurogenesis"
    • Publicações Seleccionadas

       

      • Abranches, E., Guedes, A.M.V., Moravec, M., Maamar, H., Svoboda, P., Raj, A., Henrique, D. (2014): "Stochastic NANOG fluctuations allow mouse embryonic stem cells to explore pluripotency", Development, 141, 2770-9.
      • Costa, A., Sanchez-Guardado, L., Juniat, S., Gale, J., Daudet, N., Henrique, D. (2015): “Generation of sensory hair cells by genetic programming with a combination of transcription factors”, Development, 142:1948-1959.
      • Nair, G., Abranches, E., Henrique, D., Raj, A. (2015): Heterogeneous lineage marker expression in embryonic stem cell culture is mostly dueto spontaneous differentiation”, Sci. Rep., 5:13339. doi: 10.1038/srep13339
      • Henrique, D., Abranches, E., Storey, K. (2015): “Neuromesodermal progenitors and the making of the spinal cord”, Development 142(17):2864-75.
      • Preuße, K., Schuster-Gossler, K., Tveriakhina, L., Gaspar, C., Rosa, A., Henrique, D., Gossler, A., Stauber, M.(2015): ” Context-dependent functional divergence of the Notch ligands DLL1 and DLL4 in vivo", PlosGenetics, 11(6):e1005328 doi: 10.1371/journal.pgen.1005328

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